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Le microglia regolano la crescita e l'integrità della mielina del sistema nervoso centrale

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Nov 27, 2023

Le microglia regolano la crescita e l'integrità della mielina del sistema nervoso centrale

Nature volume 613, pages

Natura volume 613, pagine 120–129 (2023) Citare questo articolo

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La mielina è necessaria per la funzione degli assoni neuronali nel sistema nervoso centrale, ma i meccanismi che supportano la salute della mielina non sono chiari. Sebbene i macrofagi nel sistema nervoso centrale siano stati implicati nella salute della mielina1, non è noto quali popolazioni di macrofagi siano coinvolte e quali aspetti influenzino. Qui mostriamo che le microglia residenti sono cruciali per il mantenimento della salute della mielina in età adulta sia nei topi che negli esseri umani. Dimostriamo che le microglia sono superflue per il rivestimento mielinico dello sviluppo. Tuttavia, sono necessari per la successiva regolazione della crescita della mielina e della funzione cognitiva associata, e per preservare l’integrità della mielina prevenendone la degenerazione. Mostriamo che la perdita della salute della mielina dovuta all'assenza di microglia è associata alla comparsa di uno stato di oligodendrociti mielinizzanti con metabolismo lipidico alterato. Inoltre, questo meccanismo è regolato attraverso l’interruzione dell’asse TGFβ1–TGFβR1. I nostri risultati evidenziano le microglia come promettenti bersagli terapeutici per condizioni in cui la crescita e l'integrità della mielina sono disregolate, come nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative2,3.

La mielina riveste gli assoni neuronali per garantire la loro salute e la rapida propagazione degli impulsi elettrici per supportare le funzioni del sistema nervoso centrale (SNC), ad esempio la cognizione. L'apprendimento e la memoria implicano la formazione di mielina e richiedono che la mielina abbia una buona integrità strutturale. Gli strati di mielina sono compattati ad uno spessore proporzionale al diametro dell'assone4; tuttavia, con l'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative, la distruzione di queste proprietà della mielina avviene attraverso l'ipermielinizzazione. Aree allargate di mielina non compattata (dove cresce la mielina) portano a una mielina più spessa, che si disfa e forma protuberanze (chiamate outfolding) e in questi contesti si verifica anche la perdita dell'integrità della mielina attraverso la degenerazione2,3,5. Questi cambiamenti nella mielina portano a disturbi cognitivi nei topi e predicono scarse prestazioni cognitive nei primati non umani anziani e negli esseri umani6,7,8,9. Tuttavia, i meccanismi fondamentali che coordinano la formazione, la crescita e l’integrità della mielina del sistema nervoso centrale non sono chiari. Ricerche recenti hanno coinvolto in questo processo una popolazione di macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, le microglia. La mielinizzazione e la generazione di oligodendrociti che formano la mielina sono compromesse in seguito alla deplezione della microglia attraverso la perdita della funzione del recettore del fattore 1 stimolante le colonie pro-sopravvivenza (CSF1R)1. Tuttavia, questo approccio prende di mira anche i macrofagi associati al confine residenti nel sistema nervoso centrale (compresi i macrofagi perivascolari) e i monociti del sangue. Pertanto, non è chiaro quali popolazioni di macrofagi regolino la mielina e non è noto il coinvolgimento specifico delle microglia nella formazione e nella salute della mielina.

Per rispondere a queste domande, abbiamo utilizzato un modello di topo transgenico recentemente sviluppato in cui il super-potenziatore dell'elemento regolatore intronico Fms (Fire) del gene Csf1r (FireΔ / Δ; Fig. 1a) viene eliminato. Questa delezione porta all'assenza di microglia dallo sviluppo (quando normalmente emergono) fino all'età adulta, mentre sono presenti altri macrofagi del sistema nervoso centrale10,11. Questi topi non presentano molti dei problemi confondenti che si verificano in altri modelli con deficit di microglia, come morte dello sviluppo, anomalie ossee e assenza di macrofagi e monociti perivascolari del sistema nervoso centrale10. Utilizzando il marcatore microgliale TMEM119, abbiamo confermato che le microglia erano impoverite nel più grande tratto di sostanza bianca del cervello, il corpo calloso (Fig. 1b). I pochi macrofagi IBA1 + conservati nei topi FireΔ / Δ erano positivi per il marcatore macrofagico perivascolare LYVE1 (Fig. 1c, d). Inoltre, la presenza di queste cellule è stata confermata dall'osservazione di cellule CD206+ adiacenti ai vasi sanguigni CD31+ (Dati estesi Fig. 1a). Le densità dei macrofagi perivascolari non erano significativamente alterate nei topi FireΔ / Δ in questo momento (Fig. 1e) o in età avanzata (Dati estesi Fig. 1b, c) nonostante la ridotta espressione di CSF1R (Dati estesi Fig. 1d-f). Numeri simili di astrociti (GFAP+SOX9+) sono stati osservati nel corpo calloso dei topi FireΔ/Δ e dei compagni di figliata Fire+/+ (cellule GFAP+SOX9+; Dati estesi Fig. 1g,h). In particolare, a un'età in cui la mielinizzazione è in corso (dal giorno 25 postnatale (P25) a P30), i topi FireΔ / Δ avevano generato oligodendrociti maturi (OLIG2 + CC1 +) (Fig. 1f, g), che formavano una proporzione simile del lignaggio degli oligodendrociti (OLIG2+) come in Fire+/+ littermates (Fig. 1h). La mielina si è formata nei topi FireΔ / Δ, come indicato dall'espressione delle proteine ​​mieliniche MAG, MBP, CNPasi, MOG e PLP nel corpo calloso (Fig. 1i e Extended Data Fig. 2a-c) e nel cervelletto (Extended Data Figura 2d,e). L'analisi ultrastrutturale ha confermato che la mielinizzazione procedeva nei topi FireΔ/Δ (Fig. 1i), senza differenze significative nel numero di assoni mielinizzati rispetto ai topi Fire+/+ (Fig. 1j) indipendentemente dal diametro dell'assone (Fig. 1k). I nostri risultati indicano che le microglia sono superflue per la maturazione degli oligodendrociti e il rivestimento mielinico dello sviluppo. Questa scoperta è in contrasto con le precedenti attribuzioni di queste funzioni alla microglia in seguito all’esaurimento di tutte le popolazioni di macrofagi del sistema nervoso centrale.

50% reduction of IBA1+ cells at 3 months of age (Extended Data Fig. 7a–c). Compared with mice fed the control diet, microglia depletion from 2 to 3 months of age resulted in enlarged inner tongues and thicker myelin (Extended Data Fig. 7d–g), whereas depletion from 5 to 6 months of age caused patchy demyelination (Extended Data Fig. 7j–l). Oligodendrocyte numbers were unchanged (Extended Data Fig. 7h,i). Therefore, microglia depletion in adult mice mirrored the hypermyelination and myelin degeneration observed at equivalent ages in FireΔ/Δ mice, which indicated that microglia are required for myelin maintenance once it is already formed./p> 0.9999, respectively; two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. h, Lipidomics analysis represented as log2(fold change (FC)) in FireΔ/Δ mice versus Fire+/+ mice, with upregulated lipid species indicated in red and downregulated lipid species indicated in blue, ordered based on desaturation of fatty acids (double bonds) and total class value (0–6). Boxes indicate lipid species of interest. SM, sphingomyelins; CE, cholesterol esters; CER, ceramides; DCER, dihydroceramides; HexCER, hexosylceramides; TG, triaglycerides; DG, diacylglycerides; PC, phosphatidylcholine; LPC, lysophosphatidylcholine; PC-O, 1-alkyl,2-acylphosphatidylcholines; PC-P, 1-alkenyl,2-acylphosphatidylcholines; PE, phosphatidylethanolamine; LPE, lysophosphatidylethanolamine; PE-O, 1-alkyl,2-acylphosphatidylethanolamines; PE-P, 1-alkenyl,2-acylphosphatidylethanolamines; PG, phosphatidylglycerol; P I, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine. n = 3 mice per group. One-sample t-test of log2(FC) against a value of 0: SM-0, **P = 0.0058; SM-3, *P = 0.0202; SM-0–6, *P = 0.0347; CE-2, *P = 0.0384; CE-6, *P = 0.0474; CE-0–6, *P = 0.0276; CER-1, *P = 0.0171; TG-1, *P = 0.0301; TG-2, *P = 0.0116; TG-3, *P = 0.0432; TG-0–6, *P = 0.0412; LPC-0, *P = 0.0415; PG-6, **P = 0.0055; PS-2, *P = 0.0459./p> 0.9999 Kruskal–Wallis with Dunn's multiple comparisons test. j, FireΔ/Δ mice were treated with SRI-011381 hydrochloride (SRI; 30 mg kg–1) or vehicle from 2–3 months of age. k, Images of FireΔ/Δ mice treated with vehicle or SRI-011381. l, Images of FireΔ/Δ mice treated with vehicle or SRI-011381 indicating inner tongue size (orange) and myelin thickness (asterisks). m, Inner tongue thickness versus axon diameter. n = 100 axons per mouse, and n = 3 vehicle treated and 4 SRI treated. ***P < 0.0001, simple linear regression of slopes. Vehicle versus SRI and versus Fire+/+, ***P < 0.0001; SRI versus Fire+/+, P = 0.0519, Kruskal–Wallis with Dunn's multiple comparisons test. n, Myelin thickness versus axon diameter. n = 100 axons per mouse, and n = 3 vehicle treated and 4 SRI treated. ***P < 0.0001, simple linear regression of slopes. Vehicle versus SRI and versus Fire+/+, ***P < 0.0001; SRI versus Fire+/+, P > 0.9999, Kruskal–Wallis with Dunn's multiple comparisons test. Scale bars, 1 µm (f,g,k,l) or 25 µm (b)./p>80% power for all experiments. Both males and females were used throughout the study, except for open-field experiments, for which only male mice were used. Animals were randomized to time points analysed. ARRIVE2 guidelines were followed in providing details of experiments, quantifications and reporting./p>

3.0.CO;2-R" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-9861%2820000410%29419%3A3%3C364%3A%3AAID-CNE8%3E3.0.CO%3B2-R" aria-label="Article reference 7" data-doi="10.1002/(SICI)1096-9861(20000410)419:33.0.CO;2-R"Article CAS Google Scholar /p> 0.9999 and 0.7698, Mann Whitney and 2-tailed unpaired Student's t-test, respectively. At 3-4 months, n = 5 FIRE+/+ and 4 FIREΔ/Δ mice, at 6 months, n = 5 FIRE+/+ and 3 FIREΔ/Δ mice. d) Flow cytometry gating strategy for assessment of non-microglial myeloid cells (including BAMs; CD11b+ CD45hi) for panels (e) and (f). e) Intensity of expression of CSF1R in FIRE+/+ and FIREΔ/Δ mice in CD11b+CD45lo microglia (MG) versus CD11b+CD45hi myeloid cells. f) Mean Fluorescence Intensity (MFI) of CSF1R ± s.e.m. in non-microglial myeloid cells (including BAMs) in FIRE+/+ and FIREΔ/Δ mice. ****P < 0.0001, 2-tailed unpaired Student's t-test. n = 4 FIRE+/+ and 5 FIREΔ/Δ mice g) Images of astrocytes (SOX9; green; GFAP+; magenta) at 1 month of age in the corpus callosum. Scale bar, 75 μm. Inset shows magnified view of double positive cells. Scale bar, 25 μm. h) Mean SOX9+ GFAP+ cells/mm2 ± s.e.m. at 1 month of age in the corpus callosum. n = 5 mice per group. Non-significant, P = 0.4799, 2-tailed unpaired Student's t-test./p>

 0.9999, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. c) Mean primary errors ± s.e.m. during training phase. n = 13 FIRE+/+ mice and 10 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, Day 1: P = 0.9649; Day 2: P = 0.5968; Day 3: P = 0.8884; Day 4: P = 0.6028; Day 5: P = 0.9215; Day 6: P = 0.9437, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. d) Mean percentage of time spent in the target quadrant± s.e.m., n = 13 FIRE+/+ and 10 FIREΔ/Δ. Dotted line indicates 25% chance. Non-significant between genotypes, 1hr: P = 0.7337; 3d: P > 0.9999, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. e) Mean number of nose pokes into holes during 1hr probe test ± s.e.m., n = 13 FIRE+/+mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Target **P = 0.0019, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. f) Mean number of nose pokes into holes during 3d probe test ± s.e.m., n = 13 FIRE+/+mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, P = 0.9329, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. g) Reversal phase: Target hole 2 (blue) is 180° from the original target; mice require cognitive flexibility to adapt to the new target. h) Mean primary latency (sec) ± s.e.m. over 3 training days. n = 13 FIRE+/+ and 9 FIREΔ/Δ. Non-significant across all training days between genotypes, Day 1: P = 0.9999; Day 2: P = 0.5186; Day 3: P = 0.9622, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. i) Mean primary errors ± s.e.m. during reversal days. n = 13 FIRE+/+ and 9 FIREΔ/Δ. Day 1: *P = 0.0488, Day 2: *P = 0.0142, Day 3: P = 0.6727, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. j) Mean percentage of time spent in the target quadrant during reversal probe test ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Dotted line indicates 25% chance. Non-significant, P = 0.6933, 2-tailed unpaired Student's t-test. k) Mean number of nose pokes into holes during reversal probe test ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant P = 0.9657, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. l) Schematic of Open Field test. m) Total distance travelled (m) during 10-min Open Field test ± s.e.m. n = 37 mice: n = 15 FIRE+/+ mice (7 young, 8 middle-aged); n = 22 FIREΔ/Δ mice (12 young, 10 middle-aged). Young mice =  4–8 weeks of age, Middle aged mice = 11–13 months of age. Non-significant, Young: P = 0.9997; Middle-aged: P > 0.999, 2-way ANOVA. n) Percentage (%) of time spent in the centre of the arena during Open Field test ± s.e.m. n = 37 mice: n = 15 FIRE+/+ mice (7 young, 8 middle-aged); n = 22 FIREΔ/Δ mice (12 young, 10 middle-aged). Young mice = 4–8 weeks of age, Middle aged mice = 11–13 months of age. Non-significant, Young: P = 0.7899; Middle-aged: P > 0.9995, 2-way ANOVA. o) Mean distance travelled (m) during training days ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, P = 0.9607, >0.9999, >0.9999, 0.9955, 0.6583, 0.6034, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. p) Mean distance travelled (m) during reversal days ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, P = 0.7856, 0.9784, 0.8626, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. q) Mean speed (m/s) during training days ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, P = 0.9998, >0.9999, 0.6667, 0.9995, 0.9831, 0.9995, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. r) Mean speed (m/s) during reversal days ± s.e.m. n = 13 FIRE+/+ mice and 9 FIREΔ/Δ mice. Non-significant, P = > 0.9999, 0.9940, 0.1561, Repeated measures 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test./p>

 0.9999; CC1-: P > 0.9999, 1-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. d) Representative images of EdU+ (magenta) CC1+ (green) OLIG2+ (white) triple positive cells (arrows). Scale bar, 25 µm. e) Images of corpus callosum 6 weeks post cognitive testing. Scale bar, 1 µm. f) Mean number of myelinated axons/mm2 ± s.e.m. in untrained versus trained mice. n = 3 mice/group in untrained category, 4 trained FIRE+/+ mice and 6 trained FIREΔ/Δ mice. FIRE+/+ mice *P = 0.0364, FIREΔ/Δ mice non-significant, P = 0.8537, 2-tailed unpaired Student's t-test. g) Mean percentage increase in myelinated axons in trained FIRE+/+ and FIREΔ/Δ mice. n = 3 mice per group in untrained category, 4 trained FIRE+/+ mice and 6 trained FIREΔ/Δ mice. h) Correlation between mean myelinated axons per mm2 and reversal day 1 (RD1) primary errors or average primary errors in FIRE+/+ and FIREΔ/Δ mice. Each data point represents an individual mouse. n = 4 FIRE+/+ and 6 trained FIREΔ/Δ mice./p>

1 µm: *P = 0.0263, 2-tailed unpaired Student's t-test. e) Images of mature oligodendrocytes co-expressing OLIG2 (white) and CC1 (magenta) at 6 months of age. Scale bar, 75 µm. f) Mean OLIG2+ CC1+ cells/mm2 ± s.e.m. n = 5 FIRE+/+ and 3 FIREΔ/Δ. Non-significant, P = 0.6400, 2-tailed unpaired Student's t-test. Mean proportion of cells of the oligodendrocyte lineage (OLIG2+) which are mature (CC1+; black) or immature (CC1-; grey) ± s.e.m. n = 5 FIRE+/+ and 3 FIREΔ/Δ. Non-significant, CC1+: P = 0.9938; CC1-: ns P = 0.9938, 1-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. g) Images of mature oligodendrocytes co-expressing OLIG2 (white) and CC1 (magenta) at 3-4 months of age. Scale bar, 75 µm. h) Mean OLIG2+ CC1+ cells/mm2 ± s.e.m. n = 5 mice/group. Non-significant, P = 0.9825, 2-tailed unpaired Student's t-test. Mean proportion of cells of the oligodendrocyte lineage (OLIG2+) which are mature (CC1+; black) or immature (CC1-; grey) ± s.e.m. n = 5 mice per group. Non-significant, CC1+: P = 0.7076; CC1-: P = 0.7076, 1-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. i) Images of FIRE+/+ and FIREΔ/Δ mouse corpus callosum at 4.5 months of age indicating onset of demyelination in the latter (magenta asterisks), examples of myelinated axons of medium-large calibre indicated by green asterisks. Scale bars, 5 µm and 1 µm. j) Mean number of myelinated axons/mm2 ± s.e.m. n = 3 mice/group. **P = 0.0042, 2-tailed unpaired Student's t-test. k) Mean myelin thickness per small (<0.6 µm) or medium-large (>0.6 µm) axon diameter bin ± s.e.m. at 3-4 months of age. n = 3 mice/group. <0.6 µm: non-significant, P = 0.8978; >0.6 µm: *P = 0.0491, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. l) Mean of diameters (0.7290 µm) of demyelinated axons per representative image ± s.e.m. in FIREΔ/Δ mice. n = 3 mice./p>

1 µm WT vs. Plp-creERT;Tgfbr1fl/fl **P = 0.0037 and Plp-creERT;Tgfbr1fl/fl vs. Tgfbr1fl/fl ***P = 0.0003, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. f) Mean number of myelinated axons ± s.e.m./axon diameter bin in 3-month-old FIREΔ/Δ mice following treatment with vehicle control or SRI-011381 hydrochloride from 2 to 3 months of age. n = 3 Vehicle-treated and 4 SRI-treated mice. Non-significant, P = 0.9202, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. g) Mean inner tongue thickness (µm) ± s.e.m. per axon diameter bin in 3-month-old FIREΔ/Δ mice following treatment with vehicle control or SRI-011381 hydrochloride from 2 to 3 months of age. n = 3 Vehicle-treated and 4 SRI-treated mice. 0.5-1.0 µm: *P = 0.0334, >1 µm: ****P < 0.0001, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. h) Mean myelin thickness (µm) ± s.e.m./axon diameter bin in 3-month-old FIREΔ/Δ mice following treatment with vehicle control or SRI-011381 hydrochloride from 2 to 3 months of age. n = 3 Vehicle-treated and 4 SRI-treated mice. 0.5-1.0 µm: **P = 0.0027, >1 µm: ****P < 0.0001, 2-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test./p>